◎ מיקרו-מתגים לטיפול צדדי ואמין בנוזלים לפי דרישה

תודה שביקרת ב-www.chinacdoe.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת החוויה הטובה ביותר, אנו ממליצים להשתמש בדפדפן מעודכן (או להשבית את מצב תאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, נעבד את האתר ללא סגנונות ו-JavaScript.

מערכות מעבדה-על-שבב עם יכולות באתר מציעות פוטנציאל לאבחון מהיר ומדויק והן שימושיות במסגרות מוגבלות במשאבים שבהם ציוד ביו-רפואי ואנשי מקצוע מיומנים אינם זמינים.עם זאת, יצירת מערכת בדיקה נקודתית הכוללת בו-זמנית את כל התכונות הדרושות לחלוקה רב-תכליתית, שחרור לפי דרישה, ביצועים אמינים ואחסון לטווח ארוך של ריאגנטים נותרה אתגר גדול.כאן אנו מתארים טכנולוגיית מתג תנועה מיקרו המופעלת באמצעות מנוף שיכולה לתפעל נוזלים בכל כיוון, לספק תגובה מדויקת ופרופורציונלית ללחץ האוויר המופעל ולהישאר יציבה מפני תנועות ורעידות פתאומיות.בהתבסס על הטכנולוגיה, אנו מתארים גם פיתוח של מערכת תגובת שרשרת פולימראז המשלבת הכנסת ריאגנטים, ערבוב ותפקודים של ריאגנטים בתהליך אחד, המשיגת ביצועים של "מדגם-in-answer-out" עבור כל דגימות האף הקליניות מ-18 חולים עם שפעת ו-18 בקרות בודדות, בהתאמה טובה של עוצמת הקרינה עם תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (מקדמי פירסון > 0.9).בהתבסס על הטכנולוגיה, אנו מתארים גם את הפיתוח של מערכת תגובת שרשרת פולימראז המשלבת הכנסת ריאגנטים, ערבוב ותפקודים של ריאגנטים בתהליך אחד, המשיגת ביצועים של "דגימה בתשובה החוצה" עבור כל דגימות האף הקליניות מ-18 מטופלים. עם שפעת ו-18 בקרות בודדות, בהתאמה טובה של עוצמת הקרינה עם תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (מקדמי פירסון > 0.9).Оноыаяа н э э э э э э э э э f -ж ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы ы т то ии ведения реаентов, сешивания рnе בך о оном процец, чо ч ч ч ч ч ч ч иничесих оразцов з носа о 18 пациентов грип (ו 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимек фициенты Пирсона> 0,9).בהתבסס על טכנולוגיה זו, אנו מתארים גם את הפיתוח של מערכת תגובת שרשרת פולימראז המשלבת את הפונקציות של הזרקה, ערבוב ותגובה בתהליך אחד, המאפשרת דגימה בתגובה החוצה לכל דגימות האף הקליניות מ-18 חולי שפעת.ו-18 בקרות בודדות, בהתאמה טובה לעוצמת הקרינה הסטנדרטית של תגובת שרשרת הפולימראז (מקדמי פירסון > 0.9).בהתבסס על טכנולוגיה זו, אנו מתארים גם את הפיתוח של מערכת תגובת שרשרת פולימראז המשלבת פונקציות הזרקת ריאגנטים, ערבוב ותגובה כדי לנתח את כל דגימות האף הקליניות מ-18 דגימות של חולי אף בדגימה. שפעת ו-18 בקרות בודדות, התאמה לעוצמת הקרינה. טוב עם תגובת שרשרת פולימראז סטנדרטית (מקדם פירסון > 0.9).הפלטפורמה המוצעת מבטיחה אוטומציה אמינה של ניתוח ביו-רפואי ובכך יכולה להאיץ את המסחור של מגוון מכשירי בדיקה נקודתיים.
מחלות אנושיות מתעוררות, כמו מגיפת COVID-19 ב-2020 שגבתה את חייהם של מיליוני אנשים, מהוות איום רציני על הבריאות העולמית ועל הציוויליזציה האנושית1.זיהוי מוקדם, מהיר ומדויק של מחלות הוא קריטי כדי לשלוט בהתפשטות הנגיף ולשפר את תוצאות הטיפול.מערכת אקולוגית אבחנתית ליבה המבוססת על מעבדות מרכזיות שבהן דגימות בדיקה נשלחות לבתי חולים או מרפאות אבחון ומנוהלות על ידי אנשי מקצוע מגבילה כיום את הגישה של כמעט 5.8 מיליארד אנשים ברחבי העולם, במיוחד אלה החיים במסגרות מוגבלות במשאבים.היכן שחסר ציוד ביו-רפואי יקר ומומחים מוסמכים.קלינאים 2. לפיכך, קיים צורך דחוף בפיתוח מערכת מעבדה על שבב זולה וידידותית למשתמש עם יכולת בדיקת נקודת טיפול (POCT) שיכולה לספק לקלינאים מידע אבחוני בזמן כדי לקבל החלטות אבחון מושכלות .וטיפול 3.
הנחיות ארגון הבריאות העולמי (WHO) קובעות ש-POCT אידיאלי צריך להיות במחיר סביר, ידידותי למשתמש (קל לשימוש עם אימון מינימלי), מדויק (הימנע שליליות שגויות או חיוביות שגויות), מהיר ואמין (לספק תכונות חוזרות טובות), וכן ניתנת למסירה (מסוגלת לאחסון לטווח ארוך וזמינה למשתמשי קצה)4.כדי לעמוד בדרישות אלו, מערכות POCT חייבות לספק את התכונות הבאות: מינון רב-תכליתי להפחתת התערבות ידנית, שחרור לפי דרישה להובלת ריאגנטים בקנה מידה לתוצאות בדיקה מדויקות, וביצועים אמינים לעמידה ברטט סביבתי.נכון לעכשיו, מכשיר ה-POCT הנפוץ ביותר הוא רצועת הזרימה הצידית5,6 המורכבת ממספר שכבות של ממברנות ניטרוצלולוזה נקבוביות שדוחפות כמות קטנה מאוד של דגימה קדימה, המגיבה עם ריאגנטים שקבועים מראש בכוח נימי.למרות שיש להם יתרון של עלות נמוכה, קלות שימוש ותוצאות מהירות, מכשירי POCT מבוססי רצועות זרימה יכולים לשמש רק לבדיקות ביולוגיות (למשל, בדיקות גלוקוז7,8 ובדיקות הריון9,10) ללא צורך בניתוח רב-שלבי.תגובות (למשל טעינה של ריאגנטים מרובים, ערבוב, ריבוי).בנוסף, הכוחות המניעים השולטים בתנועת הנוזל (כלומר, כוחות נימיים) אינם מספקים עקביות טובה, במיוחד בין אצוות, מה שגורם לשחזור לקוי11 והפיכת פסי זרימה לרוחב שימושיים בעיקר לזיהוי טוב12,13.
יכולות ייצור מורחבות בקנה מידה מיקרו וננו יצרו הזדמנויות לפיתוח מכשירי POCT מיקרופלואידיים למדידות כמותיות14,15,16,17.על ידי התאמת המאפיינים של הממשק 18, 19 והגיאומטריה של הערוצים 20, 21, 22, ניתן לשלוט בכוח הנימים וקצב הזרימה של מכשירים אלה.עם זאת, האמינות שלהם, במיוחד עבור נוזלים רטובים מאוד, נותרה בלתי מקובלת עקב אי דיוקים בייצור, פגמים בחומרים ורגישות לרעידות סביבתיות.בנוסף, מכיוון שנוצרת זרימה קפילרית בממשק נוזל-גז, לא ניתן להכניס זרימה נוספת, במיוחד לאחר מילוי תעלת המיקרו-נוזל בנוזל.לכן, לגילוי מורכב יותר, יש לבצע מספר שלבים של הזרקת דגימה24,25.
בין התקנים מיקרו-נוזליים, התקני מיקרו-נוזל צנטריפוגליים הם כיום אחד הפתרונות הטובים ביותר עבור POCT26,27.מנגנון ההנעה שלו הוא יתרון בכך שניתן לשלוט בכוח המניע על ידי התאמת מהירות הסיבוב.עם זאת, החיסרון הוא שהכוח הצנטריפוגלי מופנה תמיד לקצה החיצוני של המכשיר, מה שמקשה על יישום התגובות הרב-שלביות הנדרשות לניתוחים מורכבים יותר.למרות שכוחות הנעה נוספים (כגון נימים 28, 29 ועוד רבים אחרים 30, 31, 32, 33, 34, 35) בנוסף לכוח הצנטריפוגלי מוכנסים למינון רב-תכליתי, עדיין יכולה להתרחש העברת נוזלים בלתי צפויה מכיוון שכוחות נוספים אלו הם בדרך כלל פקודות בגודל נמוך מהכוח הצנטריפוגלי, מה שהופך אותם ליעילים רק בטווחי פעולה קטנים או שאינם זמינים לפי דרישה עם שחרור נוזל.שילוב מניפולציות פנאומטיות במיקרו-נוזליות צנטריפוגליות כגון שיטות קינטיות צנטריפוגליות 36, 37, 38, שיטות תרמופניאומטיות 39 ושיטות פנאומטיות אקטיביות 40 הוכח כחלופה אטרקטיבית.בגישה הנגדית-פוגודינמית, חלל נוסף ומיקרו-ערוצי חיבור משולבים במכשיר לפעולה חיצונית ופנימית כאחד, אם כי יעילות השאיבה שלו (בטווח שבין 75% ל-90%) תלויה מאוד במספר מחזורי השאיבה ובצמיגות של הנוזל.בשיטה התרמופניאומטית, ממברנת הלטקס ותא העברת הנוזלים תוכננו במיוחד לאטום או לפתוח מחדש את הכניסה כאשר נפח האוויר הכלוא מחומם או מקורר.עם זאת, מערך החימום/קירור מציג בעיות תגובה איטיות ומגביל את השימוש בו במבחנים רגישים לחום (למשל, הגברה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR).עם גישה פנאומטית אקטיבית, שחרור לפי דרישה ותנועה פנימה מושגות באמצעות הפעלה בו-זמנית של לחץ חיובי ומהירויות סיבוב מותאמות במדויק על ידי מנועים מהירים.ישנן גישות מוצלחות אחרות המשתמשות רק במפעילים פנאומטיים (לחץ חיובי 41, 42 או לחץ שלילי 43) ועיצובי שסתומים סגורים בדרך כלל.על ידי הפעלת לחץ ברציפות בתא הפנאומטי, הנוזל נשאב קדימה בצורה פריסטלטית, והשסתום הסגור בדרך כלל מונע זרימה חוזרת של נוזל עקב פריסטלטיקה, ובכך מממש פעולות נוזל מורכבות.עם זאת, יש כיום רק מספר מצומצם של טכנולוגיות מיקרו-נוזליות שיכולות לבצע פעולות נוזל מורכבות במכשיר POCT יחיד, כולל חלוקה רב-פונקציונלית, שחרור לפי דרישה, ביצועים אמינים, אחסון לטווח ארוך, טיפול בנוזלים בעלי צמיגות גבוהה, וייצור חסכוני.הכל באותו זמן.היעדר פעולה פונקציונלית רב-שלבית עשויה להיות גם אחת הסיבות לכך שרק מוצרי POCT מסחריים בודדים כגון Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat ורונדה הוצגו בהצלחה בשוק הפתוח עד היום.
במאמר זה, אנו מציעים מפעיל מיקרו-נוזל פנאומטי המבוסס על טכנולוגיית מיקרו-בורר טבעת ירוקה (FAST).FAST משלב את כל המאפיינים הדרושים בו-זמנית למגוון רחב של ריאגנטים ממיקרוליטר ועד מיליליטר.FAST מורכב ממברנות אלסטיות, מנופים ובלוקים.ללא הפעלת לחץ אוויר, ניתן לסגור היטב את הממברנות, המנופים והבלוקים ולאחסן את הנוזל שבתוכו לאורך זמן.כאשר מופעל לחץ מתאים ומותאם לאורך הידית, הסרעפת מתרחבת ודוחפת את הידית למצב פתוח, ומאפשרת לנוזל לעבור דרכו.זה מאפשר מדידה רב-תכליתית של נוזלים במפל, בו-זמנית, רציפה או סלקטיבית.
פיתחנו מערכת PCR המשתמשת ב-FAST ליצירת תוצאות תגובה בדגימה לזיהוי וירוסי שפעת A ו-B (IAV ו-IBV).השגנו גבול זיהוי תחתון (LOD) של 102 עותקים/מ"ל, בדיקת המרובה שלנו הראתה ספציפיות ל-IAV ו-IBV ואיפשרה פתוטייפ של וירוס השפעת.תוצאות הבדיקה הקליניות באמצעות דגימת ספוגית האף מ-18 חולים ו-18 אנשים בריאים מראות התאמה טובה בעוצמת הקרינה עם RT-PCR סטנדרטי (מקדמי פירסון > 0.9).תוצאות הבדיקה הקליניות באמצעות דגימת ספוגית האף מ-18 חולים ו-18 אנשים בריאים מראות התאמה טובה בעוצמת הקרינה עם RT-PCR סטנדרטי (מקדמי פירסון > 0.9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 доковых оответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).תוצאות הניסויים הקליניים באמצעות דגימת ספוגית אף מ-18 חולים ו-18 אנשים בריאים מראות התאמה טובה בין עוצמת הקרינה של RT-PCR סטנדרטי (מקדמי פירסון > 0.9).0.9）。。……… Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациентов и 18 ползованих тветствие между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).תוצאות הניסויים הקליניים באמצעות דגימות ספוגית אף מ-18 חולים ו-18 אנשים בריאים הראו התאמה טובה בין עוצמת הקרינה לבין RT-PCR סטנדרטי (מקדם פירסון > 0.9).עלות החומר המשוערת של מכשיר FAST-POCT היא כ-$1 (טבלה משלימה 1) וניתן להוזן עוד יותר על ידי שימוש בשיטות ייצור בקנה מידה גדול (למשל הזרקה).למעשה, למכשירי POCT מבוססי FAST יש את כל התכונות הנחוצות על ידי ארגון הבריאות העולמי והם תואמים לשיטות בדיקה ביוכימיות חדשות כגון מחזור תרמית פלזמה44, מבחני חיסון ללא הגברה45 ומבחני תפקוד ננו-גוף46 שהם עמוד השדרה של מערכות POCT.אפשרות.
על איור.1a מציג את המבנה של פלטפורמת FAST-POCT, המורכבת מארבעה תאי נוזלים: תא אחסון מראש, תא ערבוב, תא תגובה ותא פסולת.המפתח לבקרת זרימת נוזלים הוא עיצוב ה-FAST (המורכב ממברנות אלסטיות, מנופים ובלוקים) הממוקם בתא האחסון מראש ובתא הערבוב.כשיטה המופעלת פנאומטית, עיצוב ה-FAST מספק בקרת זרימת נוזלים מדויקת, כולל מיתוג סגור/פתוח, מינון רב תכליתי, שחרור נוזלים לפי דרישה, פעולה אמינה (למשל, חוסר רגישות לרטט סביבתי) ואחסון לטווח ארוך.פלטפורמת FAST-POCT מורכבת מארבע שכבות: שכבת גיבוי, שכבת סרט אלסטי, שכבת סרט פלסטיק ושכבת כיסוי, כפי שמוצג בתצוגה מוגדלת באיור 1b (מוצג בפירוט גם באיורים משלימים S1 ו-S2 ).כל התעלות ותאי הובלת הנוזלים (כגון תאי אחסון מראש ותגובה) משובצים במצעי PLA (חומצה פולילקטית) בטווח שבין 0.2 מ"מ (החלק הדק ביותר) לעובי של 5 מ"מ.חומר הסרט האלסטי הוא PDMS בעובי 300 מיקרומטר שמתרחב בקלות כאשר מופעל לחץ אוויר בשל "עובי הדק" ומודול האלסטיות הנמוך שלו (כ-2.25 MPa47).שכבת סרט הפוליאתילן עשויה מפוליאתילן טרפתלט (PET) בעובי של 100 מיקרומטר כדי להגן על הסרט האלסטי מפני דפורמציה מוגזמת עקב לחץ אוויר.בהתאמה לחדרים, לשכבת המצע יש מנופים המחוברים לשכבת הכיסוי (עשויה מ-PLA) בצירים לשליטה בזרימת הנוזל.הסרט האלסטי הודבק על שכבת הגיבוי באמצעות סרט דבק דו צדדי (ARseal 90880) וכוסה בניילון פלסטיק.שלוש שכבות הורכבו על מצע באמצעות עיצוב T-clip בשכבת הכיסוי.ל-T-clamp יש מרווח בין שתי רגליים.כאשר התפס הוכנס לתוך החריץ, שתי הרגליים כופפו מעט, ואז חזרו למצבן המקורי וכרכו היטב את המכסה והגב בזמן שעברו דרך החריץ (איור משלים. S1).לאחר מכן מרכיבים את ארבע השכבות באמצעות מחברים.
תרשים סכמטי של הפלטפורמה הממחיש את התאים הפונקציונליים השונים ואת התכונות של FAST.ב דיאגרמה מוגדלת של פלטפורמת FAST-POCT.ג תמונה של הפלטפורמה ליד מטבע של רבע דולר אמריקאי.
מנגנון העבודה של פלטפורמת FAST-POCT מוצג באיור 2. מרכיבי המפתח הם הבלוקים בשכבת הבסיס והצירים בשכבת הכיסוי, מה שמביא לעיצוב הפרעות כאשר ארבע השכבות מורכבות באמצעות צורת T. .כאשר לא מופעל לחץ אוויר (איור 2א), התאמת ההפרעה גורמת לציר להתכופף ולהתעוות, וכוח איטום מופעל דרך הידית כדי ללחוץ את הסרט האלסטי אל הבלוק, והנוזל בחלל האיטום מוגדר. כמצב אטום.יש לציין שבמצב זה, הידית כפופה כלפי חוץ, כפי שמוצג בתצוגת הצד באיור 2א.בעת אספקת אוויר (איור 2b), הממברנה האלסטית מתרחבת כלפי חוץ לכיוון הכיסוי ודוחפת את הידית כלפי מעלה, ובכך פותחת מרווח בין המנוף לבלוק לזרימת הנוזל אל החדר הבא, המוגדר כמצב פתוח. .לאחר שחרור לחץ האוויר, הידית יכולה לחזור למצבה המקורי ולהישאר הדוקה בגלל גמישות הציר.סרטוני וידאו של תנועות המנוף מוצגים בסרט המשלים S1.
א דיאגרמה סכמטית ותצלומים בסגירה.בהיעדר לחץ, הידית לוחצת את הממברנה אל הבלוק, והנוזל אטום.ב במצב טוב.כאשר מופעל לחץ, הממברנה מתרחבת ודוחפת את הידית כלפי מעלה, כך שהתעלה נפתחת ונוזל יכול לזרום.ג קבע את הגודל האופייני של הלחץ הקריטי.מידות אופייניות כוללות את אורך הידית (L), המרחק בין המחוון לציר (l) ועובי בליטת הידית (t).Fs הוא כוח הדחיסה בנקודת המצערת B. q הוא העומס המופץ באופן אחיד על הידית.Tx* מייצג את המומנט שפותח על ידי ידית הציר.לחץ קריטי הוא הלחץ הנדרש כדי להעלות את הידית ולגרום לנוזל לזרום.ד תוצאות תיאורטיות וניסיוניות של הקשר בין לחץ קריטי וגודל יסוד.n = 6 ניסויים עצמאיים בוצעו והנתונים מוצגים כ-± סטיית תקן.נתונים גולמיים מוצגים כקבצי נתונים גולמיים.
פותח מודל אנליטי המבוסס על תיאוריית האלומה כדי לנתח את התלות של הלחץ הקריטי Pc שבו הפער נפתח בפרמטרים הגיאומטריים (לדוגמה, L הוא אורך המנוף, l הוא המרחק בין הבלוק ל- ציר, S הוא המנוף אזור המגע עם הנוזל t הוא העובי של בליטת המנוף, כפי שמוצג באיור 2c).כמפורט בהערות המשלימות ובאיור המשלים S3, הפער נפתח כאשר \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), כאשר Fs הוא המומנט \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) כדי לבטל את הכוחות הקשורים להתאמת הפרעה ולגרום לציר להתכופף.התגובה הניסויית והמודל האנליטי מראים התאמה טובה (איור 2ד), מראה שהלחץ הקריטי Pc גדל עם עליית t/l וירידה ב-L, מה שמוסבר בקלות על ידי מודל האלומה הקלאסי, כלומר המומנט גדל עם t/Lift .לפיכך, הניתוח התיאורטי שלנו מראה בבירור שניתן לשלוט ביעילות על הלחץ הקריטי על ידי התאמת אורך הידית L ויחס t/l, מה שמספק בסיס חשוב לתכנון של פלטפורמת FAST-POCT.
פלטפורמת ה-FAST-POCT מספקת חלוקה רב-תכליתית (מוצג באיור 3a עם הוספה וניסוי), שהיא התכונה החשובה ביותר של POCT מוצלח, שבה נוזלים יכולים לזרום בכל כיוון ובכל סדר (מדורג, סימולטני, רציף) או רב-ערוצי סלקטיבי. מחלק .- פונקציית מינון.על איור.3a(i) מציג מצב מינון מדורג שבו שני תאים או יותר משולבים באמצעות בלוקים להפרדת המגיבים השונים ומנוף לשליטה במצב הפתוח והסגור.כאשר מופעל לחץ, הנוזל זורם מהחדר העליון לתחתון בצורה מדורגת.יש לציין שניתן למלא את תאי המפל בכימיקלים רטובים או בכימיקלים יבשים כגון אבקות ליאופיל.בניסוי באיור 3a(i), הדיו האדום מהחדר העליון זורם יחד עם אבקת הצבע הכחול (סולפט נחושת) לתוך החדר השני והופך לכחול כהה כאשר הוא מגיע לחדר התחתון.זה גם מראה את לחץ הבקרה על הנוזל הנשאב.באופן דומה, כאשר מנוף אחד מחובר לשני תאים, הוא הופך למצב הזרקה בו-זמנית, כפי שמוצג באיור.3a(ii), שבו ניתן לפזר את הנוזל באופן אחיד על פני שני חדרים או יותר בעת הפעלת לחץ.מכיוון שהלחץ הקריטי תלוי באורך הידית, ניתן לכוונן את אורך הידית כדי להשיג תבנית הזרקה רציפה כפי שמוצג באיור.3א(iii).מנוף ארוך (עם לחץ קריטי Pc_long) חובר לתא B ומנוף קצר (עם לחץ קריטי Pc_short > Pc_long) חובר לתא A. מכיוון שהופעל לחץ P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), רק הנוזל באדום יכול לזרום לתא B וכאשר הלחץ הוגבר ל-P2 (> Pc_short), הנוזל הכחול יכול לזרום לתא A. מצב הזרקה רציף זה חל על נוזלים שונים המועברים לתאים הקשורים אליהם ברצף, וזה קריטי עבור POCT מוצלח התקן.מנוף ארוך (עם לחץ קריטי Pc_long) חובר לתא B ומנוף קצר (עם לחץ קריטי Pc_short > Pc_long) חובר לתא A. מכיוון שהופעל לחץ P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), רק הנוזל באדום יכול לזרום לתא B וכאשר הלחץ הוגבר ל-P2 (> Pc_short), הנוזל הכחול יכול לזרום לתא A. מצב הזרקה רציף זה חל על נוזלים שונים המועברים לתאים הקשורים אליהם ברצף, וזה קריטי עבור POCT מוצלח התקן.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг (с критическим Pc_long) инен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может камеру B, и когда давление было увеличено до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру Эличено до камеру а применяется к различным жидкостям, последовательно перемещаемым в соответствующие камеры, чато имеще шной POCT.מנוף ארוך (עם לחץ קריטי Pc_long) חובר לתא B, ומנוף קצר (עם לחץ קריטי Pc_short > Pc_long) חובר לתא A. כאשר מופעל לחץ P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), רק הנוזל מודגש באדום יכול לזרום לתוך תא B, וכאשר הלחץ הוגבר ל-P2 (> Pc_short), הנוזל הכחול יכול לזרום לתוך תא A. מצב הזרקה רציף זה מיושם על נוזלים שונים המועברים ברצף לחדרים המתאימים, וזה קריטי עבור POCT מוצלח.התקן. Динный рычаг (критичечоרבה давение pc_long) соединен самерой b, а кגות к н с к рй. A.הזרוע הארוכה (לחץ קריטי Pc_long) מחוברת לתא B והזרוע הקצרה (לחץ קריטי Pc_short > Pc_long) מחוברת לתא A.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а_Pc_short При приложении давления ort) в камеру A может поступать синяя жидкость.כאשר מופעל לחץ P1 (Pc_long < P1 < Pc_short), רק נוזל אדום יכול להיכנס לתא B, וכאשר הלחץ מוגבר ל-P2 (> Pc_short), נוזל כחול יכול להיכנס לתא A. מצב הזרקה רציף זה מתאים להעברה רציפה של נוזלים שונים לתוך החדרים המתאימים, וזה קריטי לפעולה מוצלחת של מכשיר POCT.איור 3a(iv) מדגים את מצב ההזרקה הסלקטיבית, כאשר לתא הראשי היה מנוף קצר (עם לחץ קריטי Pc_short) וארוך (עם לחץ קריטי Pc_long < Pc_short) שהיו מחוברים לתא A ולתא B, בהתאמה, בנוסף. לתעלת אוויר נוספת המחוברת לתא B. כדי להעביר את הנוזל לתא A תחילה, הופעלו על המכשיר לחץ P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ו-P2 (P2 > P1) עם P1 + P2 > Pc_short.איור 3a(iv) מדגים את מצב ההזרקה הסלקטיבית, כאשר לתא הראשי היה מנוף קצר (עם לחץ קריטי Pc_short) וארוך (עם לחץ קריטי Pc_long < Pc_short) שהיו מחוברים לתא A ולתא B, בהתאמה, בנוסף. לתעלת אוויר נוספת המחוברת לתא B. כדי להעביר את הנוזל לתא A תחילה, הופעלו על המכשיר לחץ P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ו-P2 (P2 > P1) עם P1 + P2 > Pc_short.על איור.3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давын) (с критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A и камерой B соответстветветствет.3a(iv) מציג את מצב ההזרקה הסלקטיבית, שבו לתא הראשי היה מנוף קצר (עם לחץ קריטי Pc_short) וידית ארוכה (עם לחץ קריטי Pc_long < Pc_short), שהיו מחוברים בנוסף לתא A ולתא B, בהתאמה.кдругому воздушному каналу, соединенному с камерой ב вали давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ו- P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.לתעלת אוויר נוספת המחוברת לתא B. כדי להעביר תחילה נוזל לתא A, לחצים P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ו- P2 (P2 > P1) הופעלו בו זמנית על המכשיר, כאשר P1 + P2 > Pc_short. 3 (iv) показан режим селивהго врыа, кога оновнам каеера им'י ки али'י) ый тержень (критичесим le ззшном канал подключенному к комнате B.3a(iv) מציג את מצב ההזרקה הסלקטיבית כאשר לתא הראשי יש גזע קצר (לחץ קריטי Pc_short) וגזע ארוך (לחץ קריטי Pc_long < Pc_short) המחוברים לתא A ולתא B בהתאמה, ובנוסף למעבר אוויר נוסף, מחובר לחדר ב'.לפיכך, P2 מונע כניסת נוזלים לתא B;בינתיים, הלחץ הכולל P1 + P2 עלה על הלחץ הקריטי כדי להפעיל את הידית הקצרה יותר המחוברת לתא A כדי לאפשר את זרימת הנוזל לתא A. לאחר מכן, כאשר נדרש למלא תא B, עלינו להפעיל רק P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) בתא הראשי כדי להפעיל את הידית הארוכה ולאפשר לנוזל לזרום לתא B. ניתן להבחין בבירור מזמן t = 3 ש' עד 9 שניות שהנוזל בתא A נשאר קבוע בזמן שהוא גדל בתא B כאשר הופעל לחץ P1.בינתיים, הלחץ הכולל P1 + P2 עלה על הלחץ הקריטי כדי להפעיל את הידית הקצרה יותר המחוברת לתא A כדי לאפשר את זרימת הנוזל לתא A. לאחר מכן, כאשר נדרש למלא תא B, עלינו להפעיל רק P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) בתא הראשי כדי להפעיל את הידית הארוכה ולאפשר לנוזל לזרום לתא B. ניתן להבחין בבירור מזמן t = 3 ש' עד 9 שניות שהנוזל בתא A נשאר קבוע בזמן שהוא גדל בתא B כאשר הופעל לחץ P1.Меж тем, ощels давение p1 + p2 преыилדיר A, чоы позолит жидоси теч в камеру затем, кога требет з з н з קצר ) в основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и дать жидкости течь в камеру B. Можно ясно 3 עד 9 עם жидкость в камере A оставалась постоянной, в то время как в камере она увеличивалась.בינתיים, הלחץ הכולל P1 + P2 עלה על הלחץ הקריטי כדי להפעיל מנוף קצר יותר המחובר לתא A כדי לאפשר לנוזל לזרום לתוך תא A. לאחר מכן, כאשר יש צורך למלא תא B, עלינו להפעיל רק P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) בתא הראשי כדי להפעיל את הידית הארוכה ולתת לנוזל לזרום לתוך תא B. ניתן להבחין בבירור שבין t = 3 s ל 9 s הנוזל בתא A נשאר קבוע, בעוד בתא הוא גדל.B כאשר לחץ P1 מופעל.במקביל, הלחץ הכולל P1 + P2 עולה על הלחץ הקריטי, מפעיל את המנוף הקצר יותר המחבר את תא A, ומאפשר לנוזל לזרום לתוך תא A.כשמגיע הזמן למלא את תא A, אנו פשוט מיישמים P1 בתא הראשי ו-P2 בתא המשני.בדרך זו, ניתן להחליף את התנהגות הזרימה באופן סלקטיבי בין מצלמות A ו-B. ניתן למצוא את התנהגות הזרימה של ארבעת מצבי ההפצה הרב-פונקציונליים בסרט המשלים S2.
איור של הקצאה רב תכליתית, כלומר (i) מדורגת, (ii) סימולטנית, (iii) רציפה ו-(iv) הקצאה סלקטיבית.העקומות מייצגות את זרימת העבודה והפרמטרים של ארבעת מצבי הפצה אלה.ב תוצאות של בדיקות אחסון ארוכות טווח במים דה-יונים ובאתנול.n = 5 ניסויים עצמאיים בוצעו והנתונים מוצגים כ- ± sd c.הדגמות בדיקת יציבות כאשר התקן FAST והתקן השסתום הנימים (CV) היו במצב (i) סטטי ו-(ii) רטט.(iii) עוצמת קול לעומת זמן עבור התקני FAST ו-CV בתדרים זוויתיים שונים.ד פרסום תוצאות בדיקה לפי דרישה עבור (i) מכשיר FAST ו-(ii) מכשיר CV.(iii) קשר בין נפח וזמן עבור התקני FAST ו- CV המשתמשים במצב לחץ לסירוגין.כל פסי קנה מידה, 1 ס"מ.נתונים גולמיים מסופקים כקבצי נתונים גולמיים.
אחסון לטווח ארוך של ריאגנטים הוא תכונה חשובה נוספת של מכשיר POCT מוצלח שיאפשר לצוות לא מאומן לטפל במספר ריאגנטים.בעוד שטכנולוגיות רבות הראו את הפוטנציאל שלהן לאחסון לטווח ארוך (למשל, 35 מכשירי מיקרו, 48 חבילות שלפוחיות ו-49 חבילות סטיק), נדרש תא קליטה ייעודי כדי להכיל את החבילה, מה שמגדיל את העלות והמורכבות;יתר על כן, מנגנוני אחסון אלו אינם מאפשרים חלוקה לפי דרישה וגורמים לבזבוז של ריאגנטים עקב שאריות באריזה.יכולת אחסון לטווח ארוך אומתה על ידי ביצוע מבחן חיים מואץ באמצעות חומר PMMA בעיבוד CNC בשל החספוס הקל שלו ועמידותו בפני חדירת גז (איור משלים S5).מכשיר הבדיקה היה מלא במים מפושטים (מים מפושטים) ו-70% אתנול (מדמים ריאגנטים נדיפים) ב-65 מעלות צלזיוס למשך 9 ימים.גם מים מפושטים וגם אתנול אוחסנו באמצעות רדיד אלומיניום כדי לחסום את הגישה מלמעלה.משוואת Arrhenius ואנרגיית הפעלת החדירה המדווחת בספרות50,51 שימשו לחישוב המקבילה בזמן אמת.על איור.3b מציג את תוצאות הירידה במשקל הממוצעות עבור 5 דגימות המאוחסנות ב-65 מעלות צלזיוס למשך 9 ימים, שווה ערך ל-0.30% עבור מים מפושטים ו-0.72% עבור 70% אתנול במשך שנתיים ב-23 מעלות צלזיוס.
על איור.3c מציג את מבחן הרטט.מכיוון שהשסתום הנימים (CV) הוא שיטת הטיפול הנוזלים הפופולרית ביותר בקרב התקני POCT28,29 הקיימים, נעשה שימוש בהתקן CV ברוחב 300 מיקרומטר ועומק של 200 מיקרומטר לצורך השוואה.ניתן לראות שכאשר שני המכשירים נשארים נייחים, הנוזל בפלטפורמת FAST-POCT אוטם והנוזל בהתקן ה-CV ננעל עקב התרחבות פתאומית של התעלה, מה שמפחית את כוחות הנימים.עם זאת, ככל שהתדר הזוויתי של ויברטור המסלול עולה, הנוזל בפלטפורמת FAST-POCT נשאר אטום, אך הנוזל בהתקן ה-CV זורם לתוך החדר התחתון (ראה גם סרט משלים S3).זה מצביע על כך שהצירים הניתנים לעיוות של פלטפורמת FAST-POCT יכולים להפעיל כוח מכני חזק על המודול כדי לסגור בחוזקה את הנוזל בתא.עם זאת, במכשירי CV, נוזל נשמר עקב האיזון בין השלב המוצק, האוויר והנוזל, יצירת אי יציבות, ורעידות עלולות להפר את האיזון ולגרום להתנהגות זרימה בלתי צפויה.היתרון של פלטפורמת FAST-POCT הוא בכך שהיא מספקת פונקציונליות אמינה ומונעת כשלים בנוכחות רעידות המתרחשות בדרך כלל במהלך אספקה ​​ותפעול.
תכונה חשובה נוספת של פלטפורמת FAST-POCT היא השחרור שלה לפי דרישה, שהיא דרישת מפתח לניתוח כמותי.על איור.3d משווה את ההפצה לפי דרישה של פלטפורמת FAST-POCT ומכשיר ה-CV.מתוך איור.3d(iii) אנו רואים שהמכשיר FAST מגיב במהירות לאות הלחץ.כאשר הופעל לחץ על פלטפורמת FAST-POCT, הנוזל זרם, כאשר הלחץ שוחרר, הזרימה נעצרה מיד (איור 3d(i)).פעולה זו יכולה להיות מוסברת על ידי החזרה אלסטית מהירה של הציר, אשר לוחצת את הידית בחזרה אל הבלוק, וסוגרת את החדר.עם זאת, הנוזל המשיך לזרום בהתקן ה-CV, מה שהביא בסופו של דבר לנפח נוזל בלתי צפוי של כ-100 µl לאחר שחרור הלחץ (איור 3d(ii) וסרט משלים S4).ניתן להסביר זאת על ידי היעלמות אפקט ההצמדה הנימים לאחר הרטבה מלאה של ה-CV לאחר ההזרקה הראשונה.
היכולת להתמודד עם נוזלים בעלי יכולת הרטבה וצמיגות משתנים באותו מכשיר נותרה אתגר עבור יישומי POCT.הרטבה ירודה עלולה להוביל לדליפות או להתנהגות זרימה בלתי צפויה אחרת בתעלות, וציוד נלווה כגון מערבלי מערבולת, צנטריפוגות ומסננים נדרשים לעתים קרובות להכנת נוזלים צמיגיים מאוד 52 .בדקנו את הקשר בין לחץ קריטי לתכונות הנוזל (עם מגוון רחב של הרטבה וצמיגות).התוצאות מוצגות בטבלה 1 ובווידאו S5.ניתן לראות כי ניתן לאטום בתא נוזלים בעלי יכולת הרטבה וצמיגות שונים, ובעת הפעלת לחץ ניתן להעביר אפילו נוזלים עם צמיגות של עד 5500 cP לתא הסמוך, מה שמאפשר לזהות דגימות בעלות גבוהה צמיגות (כלומר כיח, דגימה צמיגה מאוד המשמשת לאבחון מחלות בדרכי הנשימה).
על ידי שילוב של מכשירי ההחלקה הרב-תכליתיים הנ"ל, ניתן לפתח מגוון רחב של מכשירי POCT מבוססי FAST.דוגמה מוצגת באיור 1. המפעל מכיל תא אחסון מראש, תא ערבוב, תא תגובה ותא פסולת.ריאגנטים עשויים להיות מאוחסנים בתא האחסון מראש לפרקי זמן ממושכים ולאחר מכן לפרוק לתוך תא הערבוב.עם הלחץ הנכון, ניתן להעביר את המגיבים המעורבים באופן סלקטיבי לתא פסולת או לתא תגובה.
מכיוון שזיהוי PCR הוא תקן הזהב לאיתור פתוגנים כמו H1N1 ו-COVID-19 וכולל שלבי תגובה מרובים, השתמשנו בפלטפורמת FAST-POCT לזיהוי PCR כאפליקציה.על איור.4 מציג את תהליך בדיקת PCR באמצעות פלטפורמת FAST-POCT.ראשית, המגיב הפורק, מגיב המיקרו-חרוזים המגנטי, תמיסת הכביסה A ותמיסת השטיפה W הועברו לפיפטה לתאי האחסון מראש E, M, W1 ו-W2, בהתאמה.השלבים של ספיחת RNA מוצגים באיור.4a והם כדלקמן: (1) כאשר מופעל לחץ P1 (=0.26 בר), המדגם עובר לתוך תא M ומשוחרר לתא הערבוב.(2) לחץ אוויר P2 (= 0.12 בר) מסופק דרך יציאה A המחוברת לתחתית תא הערבוב.למרות שמספר שיטות ערבוב הראו את הפוטנציאל שלהן בערבוב נוזלים על פלטפורמות POCT (למשל ערבוב סרפנטין 53, ערבוב אקראי 54 וערבוב אצווה 55), יעילות הערבוב ויעילותן עדיין אינן משביעות רצון.הוא מאמץ את שיטת ערבוב הבועות, שבה מכניסים אוויר לתחתית תא הערבוב ליצירת בועות בנוזל, ולאחר מכן המערבולת העוצמתית יכולה להגיע לערבוב מלא תוך שניות.בוצעו ניסויים של ערבוב בועות והתוצאות מוצגות באיור משלים S6.ניתן לראות שכאשר מופעל לחץ של 0.10 בר, ערבוב מלא לוקח כ-8 שניות.על ידי הגדלת הלחץ ל-0.20 בר, ערבוב מלא מושג תוך כ-2 שניות.שיטות לחישוב יעילות הערבוב מוצגות בסעיף שיטות.(3) השתמש במגנט רובידיום כדי לחלץ את החרוזים, ולאחר מכן לחץ על P3 (= 0.17 בר) דרך יציאה P כדי להעביר את הריאגנטים לתוך תא הפסולת.על איור.4b,c מציג את שלבי הכביסה להסרת זיהומים מהמדגם באופן הבא: (1) תמיסת הכביסה A מהתא W1 מוזרקת לתוך תא ערבוב הלחץ P1.(2) לאחר מכן בצע את תהליך ערבוב הבועות.(3) תמיסת הכביסה A מועברת לתא נוזל הפסולת, והמיקרו-חרוזים בתא הערבוב נשלפים החוצה על ידי המגנט.כביסה W (איור 4 ג) דומה לכביסה A (איור 4 ב).יש לציין שכל שלב כביסה A ו-W בוצע פעמיים.איור 4ד מציג את שלבי הגלישה כדי לשחרר את ה-RNA מהחרוזים;שלבי ההקדמה והערבוב זהים לשלבי ספיחת ה-RNA והשטיפה שתוארו לעיל.כאשר ריאגנטים הפליטה מועברים לתוך תא התגובה של PCR תחת לחצים P3 ו-P4 (=0.23 בר), הלחץ הקריטי מושג כדי לאטום את הזרוע של תא התגובה של PCR.באופן דומה, לחץ P4 עוזר גם לאטום את המעבר לתא הפסולת.לפיכך, כל ריאגנטים האלוציה חולקו באופן שווה בין ארבעת תאי התגובה של ה-PCR כדי להתחיל את תגובות ה-PCR המרובות.ההליך לעיל מוצג בסרט המשלים S6.
בשלב ספיחת ה-RNA, הדגימה מוכנסת לכניסה M ומוזרקת לתא הערבוב יחד עם תמיסת החרוזים המאוחסנת קודם לכן.לאחר ערבוב והסרת הגרגירים, הריאגנטים מחולקים לתוך תא הפסולת.שלבי כביסה b ו-c, הכנס ריאגנטים שונים לכביסה המאוחסנים מראש לתא הערבוב, ולאחר ערבוב והסרת החרוזים, העביר את הריאגנטים לתא הנוזל הפסולת.ד שלב חלוקה: לאחר הכנסת ריאגנטים לניקוי, ערבוב ומיצוי חרוזים, הריאגנטים מועברים לתא התגובה של PCR.העקומות מציגות את זרימת העבודה והפרמטרים הקשורים לשלבים השונים.לחץ הוא הלחץ המופעל דרך החדרים הבודדים.נפח הוא נפח הנוזל בתא הערבוב.כל פסי קנה המידה הם 1 ס"מ.נתונים גולמיים מסופקים כקבצי נתונים גולמיים.
בוצע הליך בדיקת PCR ואיור משלים S7 מציג פרופילים תרמיים הכוללים 20 דקות של זמן שעתוק הפוך ו-60 דקות של זמן מחזור תרמי (95 ו-60 מעלות צלזיוס), כאשר מחזור תרמי אחד הוא 90 שניות (סרט משלים S7)..FAST-POCT דורש פחות זמן להשלמת מחזור תרמי אחד (90 שניות) מאשר RT-PCR רגיל (180 שניות עבור מחזור תרמי אחד).ניתן להסביר זאת על ידי יחס שטח הפנים לנפח הגבוה והאינרציה התרמית הנמוכה של תא התגובה המיקרו-PCR.משטח החדר הוא 96.6 מ"מ ונפח החדר הוא 25 מ"מ, מה שהופך את יחס המשטח לנפח של כ-3.86.כפי שניתן לראות באיור משלים S10, לאזור בדיקת ה-PCR של הפלטפורמה שלנו יש חריץ בפאנל האחורי, מה שהופך את תחתית תא ה-PCR לעובי של 200 מיקרומטר.כרית אלסטית מוליכה תרמית מחוברת למשטח החימום של בקר הטמפרטורה, מה שמבטיח מגע הדוק עם החלק האחורי של תיבת הבדיקה.זה מפחית את האינרציה התרמית של הפלטפורמה ומשפר את יעילות החימום/קירור.במהלך מחזוריות תרמית, הפרפין המוטבע בפלטפורמה נמס וזורם לתוך תא התגובה של PCR, ופועל כחומר איטום למניעת אידוי מגיב וזיהום סביבתי (ראה סרט משלים S8).
כל תהליכי זיהוי ה-PCR המתוארים לעיל היו אוטומטיים לחלוטין באמצעות מכשיר FAST-POCT בהתאמה אישית, המורכב מיחידת בקרת לחץ מתוכנתת, יחידת מיצוי מגנטית, יחידת בקרת טמפרטורה ויחידת לכידת ועיבוד אותות ניאון.יש לציין, השתמשנו בפלטפורמת FAST-POCT לבידוד RNA ולאחר מכן השתמשנו בדגימות ה-RNA שחולצו לתגובות PCR באמצעות מערכת FAST-POCT ומערכת PCR שולחנית לצורך השוואה.התוצאות היו כמעט זהות למוצג באיור המשלים S8.המפעיל מבצע משימה פשוטה: מכניס את המדגם לתא ה-M ומכניס את הפלטפורמה למכשיר.תוצאות בדיקה כמותיות זמינות תוך כ-82 דקות.מידע מפורט על כלי FAST-POCT ניתן למצוא באיור המשלים.C9, C10 ו-C11.
שפעת הנגרמת על ידי נגיפי שפעת A (IAV), B (IBV), C (ICV) ו-D (IDV) היא תופעה עולמית נפוצה.מתוכם, IAV ו-IBV אחראים למקרים הקשים ביותר ולמגיפות עונתיות, מדביקות 5-15% מאוכלוסיית העולם, גורמות ל-3-5 מיליון מקרים חמורים וגורמות ל-290,000-650,000 מקרי מוות בשנה.מחלות בדרכי הנשימה56,57.אבחון מוקדם של IAV ו-IB חיוני להפחתת התחלואה והנטל הכלכלי הנלווה.בין טכניקות האבחון הזמינות, תגובת שרשרת הפולימראז ההפוכה (RT-PCR) נחשבת לרגישה, הספציפית והמדויקת ביותר (>99%)58,59.בין טכניקות האבחון הזמינות, תגובת שרשרת הפולימראז ההפוכה (RT-PCR) נחשבת לרגישה, הספציפית והמדויקת ביותר (>99%)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (Онат-Псчив тельной, специфичной и точной (> 99%)58,59.בין שיטות האבחון הזמינות, תגובת שרשרת טרנסקריפטאז פולימראז הפוכה (RT-PCR) נחשבת לרגישה, הספציפית והמדויקת ביותר (> 99%)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТеразная) льной, специфичной и точной (>99%)58,59.מבין שיטות האבחון הזמינות, תגובת שרשרת טרנסקריפטאז פולימראז הפוכה (RT-PCR) נחשבת לרגישה, הספציפית והמדויקת ביותר (>99%)58,59.עם זאת, שיטות RT-PCR מסורתיות דורשות פיפטציה חוזרת, ערבוב, חלוקה והעברה של נוזל, מה שמגביל את השימוש בהן על ידי אנשי מקצוע במסגרות מוגבלות במשאבים.כאן, פלטפורמת FAST-POCT שימשה לזיהוי PCR של IAV ו-IBV, בהתאמה, כדי להשיג את גבול הגילוי התחתון שלהם (LOD).בנוסף, IAV ו-IBV עברו ריבוי כדי להבחין בין פתוטיפים שונים על פני מינים, מה שמספק פלטפורמה מבטיחה לניתוח גנטי ויכולת לטפל במדויק במחלה.
על איור.5a מציג את התוצאות של בדיקת HAV PCR תוך שימוש ב-150 μl של RNA ויראלי מטוהר כדגימה.על איור.5a(i) מראה כי בריכוז HAV של 106 עותקים/מ"ל, עוצמת הקרינה (ΔRn) יכולה להגיע ל-0.830, וכאשר הריכוז מופחת ל-102 עותקים/מ"ל, ΔRn עדיין יכול להגיע ל-0.365, מה שמתאים גבוה מזה. מקבוצת הביקורת השלילית הריקה (0.002), גבוה פי 100 בערך.לכימות המבוסס על שישה ניסויים בלתי תלויים, נוצרה עקומת כיול ליניארית בין ריכוז לוג וסף מחזור (Ct) של IAV (איור 5a(ii)), R2 = 0.993, הנעה בין 102-106 עותקים/מ"ל.התוצאות עולות בקנה אחד עם שיטות RT-PCR קונבנציונליות.על איור.5a(iii) מציג תמונות פלורסנט של תוצאות בדיקה לאחר 40 מחזורים של פלטפורמת FAST-POCT.מצאנו שפלטפורמת FAST-POCT יכולה לזהות HAV עד 102 עותקים/מ"ל.עם זאת, לשיטה המסורתית אין ערך Ct של 102 עותקים/מ"ל, מה שהופך אותה ל-LOD של כ-103 עותקים/מ"ל.שיערנו שייתכן שזה נובע מהיעילות הגבוהה של ערבוב בועות.ניסויי בדיקת PCR בוצעו על IAV RNA מטוהר כדי להעריך שיטות ערבוב שונות, כולל ערבוב שייק (אותה שיטת ערבוב כמו בפעולת RT-PCR קונבנציונלית), ערבוב בקבוקונים (שיטה זו, 3 שניות ב-0.12 בר) וללא ערבוב כקבוצת ביקורת ..את התוצאות ניתן למצוא באיור משלים S12.ניתן לראות שבריכוז RNA גבוה יותר (106 עותקים/מ"ל), ערכי ה-Ct של שיטות הערבוב השונות כמעט זהים לאלו של ערבוב בועות.כאשר ריכוז ה-RNA ירד ל-102 עותקים/מ"ל, לתערובת השייק ולבקרות לא היו ערכי Ct, בעוד ששיטת תערובת הבועות עדיין נתנה ערך Ct של 36.9, שהיה מתחת לסף Ct של 38. התוצאות מראות מאפיין ערבוב דומיננטי שלפוחיות, אשר הוכחו גם בספרות אחרת, מה שעשוי גם להסביר מדוע הרגישות של פלטפורמת FAST-POCT מעט גבוהה יותר מ-RT-PCR רגיל.על איור.5b מציג את התוצאות של ניתוח PCR של דגימות IBV RNA מטוהרות בטווח שבין 101 ל-106 עותקים/מ"ל.התוצאות היו דומות לבדיקת IAV, והשיגו R2 = 0.994 ו-LOD של 102 עותקים/מ"ל.
ניתוח PCR של וירוס שפעת A (IAV) עם ריכוזי IAV הנעים בין 106 ל-101 עותקים/מ"ל באמצעות חיץ TE כביקורת שלילית (NC).(i) עקומת הקרינה בזמן אמת.(ii) עקומת כיול לינארית בין ריכוז IAV RNA לוגריתמי וסף מחזור (Ct) עבור FAST ושיטות בדיקה קונבנציונליות.(iii) תמונת פלורסנט של IAV FAST-POCT לאחר 40 מחזורים.ב, זיהוי PCR של וירוס שפעת B (IBV) עם (i) ספקטרום הקרינה בזמן אמת.(ii) עקומת כיול לינארית ו-(iii) תמונת הקרינה FAST-POCT IBV לאחר 40 מחזורים.הגבול התחתון של זיהוי (LOD) עבור IAV ו-IBV באמצעות פלטפורמת FAST-POCT היה 102 עותקים/מ"ל, שהוא נמוך משיטות קונבנציונליות (103 עותקים/מ"ל).ג תוצאות בדיקות מרובה עבור IAV ו-IBV.GAPDH שימש כביקורת חיובית ומאגר TE שימש כבקרה שלילית כדי למנוע זיהום אפשרי והגברת רקע.ניתן להבחין בין ארבעה סוגי דגימות שונים: (1) דגימות שליליות של GAPDH בלבד ("IAV-/IBV-");(2) זיהום IAV ("IAV+/IBV-") עם IAV ו- GAPDH;(3) זיהום IBV ("IAV-/IBV+") עם IBV ו- GAPDH;(4) זיהום IAV/IBV ("IAV+/IBV+") עם IAV, IBV ו-GAPDH.הקו המקווקו מייצג את קו הסף.n = 6 ניסויים בלתי תלויים ביולוגית בוצעו, הנתונים מוצגים כ-± סטיית תקן.נתונים גולמיים מוצגים כקבצי נתונים גולמיים.
על איור.5c מציג את תוצאות בדיקת המרבה עבור IAV/IBV.כאן, lysate וירוס שימש כתמיסת דגימה במקום RNA מטוהר, וארבעה פריימרים עבור IAV, IBV, GAPDH (בקרה חיובית) ומאגר TE (בקרה שלילית) נוספו לארבעה תאי תגובה שונים של פלטפורמת FAST-POCT.כאן נעשה שימוש בבקרות חיוביות ושליליות כדי למנוע זיהום אפשרי ושיפור רקע.הבדיקות חולקו לארבע קבוצות: (1) דגימות GAPDH שליליות ("IAV-/IBV-");(2) נגועים ב-IAV ("IAV+/IBV-") לעומת IAV ו-GAPDH;(3) IBV-.נגועים ("IAV-") -/IBV+") IBV ו-GAPDH;(4) זיהום IAV/IBV ("IAV+/IBV+") עם IAV, IBV ו-GAPDH.על איור.5c מראה שכאשר הוחלו דגימות שליליות, עוצמת הקרינה ΔRn של תא הבקרה החיובית הייתה 0.860, וה-ΔRn של IAV ו-IBV היה דומה לבקרה השלילית (0.002).עבור קבוצות IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ ו-IAV+/IBV+, המצלמות IAV/GAPDH, IBV/GAPDH ו-IAV/IBV/GAPDH הראו עוצמת קרינה משמעותית, בהתאמה, בעוד שהמצלמות האחרות אפילו הראו עוצמת הקרינה ברקע רמה של 40 לאחר רכיבה תרמית.מהבדיקות שלמעלה, פלטפורמת FAST-POCT הראתה סגוליות יוצאת דופן ואפשרה לנו לפתוטיפוס בו-זמנית של נגיפי שפעת שונים.
כדי לאמת את הישימות הקלינית של FAST-POCT, בדקנו 36 דגימות קליניות (דגימות ספוגית אף) מחולי IB (n=18) וביקורות שאינן IB (n=18) (איור 6a).מידע על המטופל מוצג בטבלה משלימה 3. מצב זיהום ב-IB אושר באופן עצמאי ופרוטוקול המחקר אושר על ידי בית החולים הראשון של אוניברסיטת Zhejiang (Hangzhou, Zhejiang).כל מדגם של חולים חולק לשתי קטגוריות.אחד עובד באמצעות FAST-POCT והשני עבר באמצעות מערכת PCR שולחנית (SLAN-96P, סין).שני המבחנים משתמשים באותן ערכות טיהור וזיהוי.על איור.6b מציג את התוצאות של FAST-POCT ו-PCR קונבנציונלי של שעתוק הפוך (RT-PCR).השווינו את עוצמת הקרינה (FAST-POCT) עם -log2(Ct), כאשר Ct הוא סף המחזור עבור RT-PCR קונבנציונלי.הייתה הסכמה טובה בין שתי השיטות.FAST-POCT ו-RT-PCR הראו מתאם חיובי חזק עם ערך יחס פירסון (r) של 0.90 (איור 6b).לאחר מכן הערכנו את הדיוק האבחוני של FAST-POCT.התפלגויות עוצמת הקרינה (FL) עבור דגימות חיוביות ושליליות סופקו כמדד אנליטי עצמאי (איור 6c).ערכי FL היו גבוהים משמעותית בחולי IB מאשר בביקורת (****P = 3.31 × 10-19; מבחן t דו-זנבתי) (איור 6d).לאחר מכן, שורטטו עקומות מאפייני הפעלה של מקלט IBV (ROC).מצאנו שדיוק האבחון היה טוב מאוד, עם שטח מתחת לעקומה של 1 (איור 6ה).אנא שימו לב כי עקב הזמנת מסכות חובה בסין עקב COVID-19 החל משנת 2020, לא זיהינו חולים עם IBD, כך שכל הדגימות הקליניות החיוביות (כלומר, דגימות משטח האף) היו עבור IBV בלבד.
עיצוב מחקר קליני.בסך הכל נותחו 36 דגימות, כולל 18 דגימות של חולים ו-18 בדיקות ללא שפעת, באמצעות פלטפורמת FAST-POCT ו-RT-PCR קונבנציונלי.ב הערכת העקביות האנליטית בין FAST-POCT PCR לבין RT-PCR רגיל.התוצאות היו בקורלציה חיובית (Pearson r = 0.90).ג רמות עוצמת הקרינה ב-18 חולי IB ו-18 ביקורת.ד בחולי IB (+), ערכי FL היו גבוהים משמעותית מאשר בקבוצת הביקורת (-) (****P = 3.31 × 10-19; מבחן t דו-זנבתי; n = 36).עבור כל חלקה מרובעת, הסמן השחור במרכז מייצג את החציון, והקווים התחתונים והעליונים של התיבה מייצגים את האחוזון ה-25 וה-75, בהתאמה.השפם מתרחב עד לנקודות המינימום והמקסימום, שאינן נחשבות לחריגות.עקומת ROC.הקו המקווקו d מייצג את ערך הסף המוערך מניתוח ROC.ה-AUC עבור IBV הוא 1. נתונים גולמיים מסופקים כקובצי נתונים גולמיים.
במאמר זה אנו מציגים את FAST, בעל המאפיינים הנדרשים עבור POCT אידיאלי.היתרונות של הטכנולוגיה שלנו כוללים: (1) מינון רב-תכליתי (מדורג, סימולטני, רציף וסלקטיבי), שחרור לפי דרישה (שחרור מהיר ופרופורציונלי של לחץ מופעל) והפעלה אמינה (רעידות ב-150 מעלות) (2) אחסון לטווח ארוך (שנתיים של בדיקות מואצות, ירידה במשקל כ-0.3%);(3) היכולת לעבוד עם נוזלים עם מגוון רחב של הרטבה וצמיגות (צמיגות עד 5500 cP);(4) חסכוני (עלות החומר המשוערת של מכשיר FAST-POCT PCR היא כ-$1).על ידי שילוב של מתקנים רב-תכליתיים, הודגמה ויישמה פלטפורמת FAST-POCT משולבת לזיהוי PCR של וירוסי שפעת A ו-B.FAST-POCT לוקח רק 82 דקות.הבדיקות הקליניות עם 36 דגימות ספוגית אף הראו התאמה טובה בעוצמת הקרינה עם RT-PCR סטנדרטי (מקדמי פירסון > 0.9).הבדיקות הקליניות עם 36 דגימות ספוגית אף הראו התאמה טובה בעוצמת הקרינה עם RT-PCR סטנדרטי (מקדמי פירסון > 0.9).(קליניקה עם 36 אוברציות של שיטות טכנולוגיה-רפואה эффициенты Пирсона > 0,9).בדיקות קליניות עם 36 דגימות של משטחי אף הראו התאמה טובה עם עוצמת הקרינה של RT-PCR סטנדרטי (מקדמי פירסון > 0.9).RT-PCR (קלינית סקירה 36 אופציות לתקשורת אינטנסיבית לתקשורת эффициент Пирсона > 0,9).בדיקה קלינית של 36 דגימות ספוגית אף הראתה התאמה טובה של עוצמת הקרינה עם RT-PCR סטנדרטי (מקדם פירסון > 0.9).במקביל לעבודה זו, שיטות ביוכימיות שונות (כגון, מחזור תרמית פלזמה, מבחני אימונו ללא הגברה ומבחני פונקציונליזציה של ננו-גוף) הראו את הפוטנציאל שלהן ב-POCT.עם זאת, בשל היעדר פלטפורמת POCT משולבת וחזקה במלואה, שיטות אלו דורשות בהכרח הליכי עיבוד מקדים נפרדים (למשל, RNA isolation44, incubation45 ו- washing46), אשר משלים עוד יותר את העבודה הנוכחית עם שיטות אלו ליישום פונקציות POCT מתקדמות עם את הפרמטרים הנדרשים.ביצועי פלט אחזור בתגובה.בעבודה זו, למרות שמשאבת האוויר המשמשת להפעלת שסתום ה-FAST קטנה מספיק כדי להשתלב במכשיר משטח עבודה (איור S9, S10), היא עדיין צורכת כוח משמעותי ויוצרת רעש.באופן עקרוני, משאבות פנאומטיות קטנות יותר ניתנות להחלפה באמצעים אחרים, כגון שימוש בכוח אלקטרומגנטי או הפעלת אצבע.שיפורים נוספים עשויים לכלול, למשל, התאמת ערכות למבחנים ביוכימיים שונים וספציפיים, תוך שימוש בשיטות זיהוי חדשות שאינן דורשות מערכות חימום/קירור, ובכך לספק פלטפורמת POCT נטולת כלים עבור יישומי PCR.אנו מאמינים שבהתחשב בכך שפלטפורמת FAST מספקת דרך לתמרן נוזלים, אנו מאמינים שטכנולוגיית FAST המוצעת מציגה פוטנציאל ליצור פלטפורמה משותפת לא רק לבדיקות ביו-רפואיות, אלא גם לניטור סביבתי, בדיקות איכות מזון, סינתזת חומרים ותרופות ..
האיסוף והשימוש בדגימות ספוגית אף אנושית אושרו על ידי ועדת האתיקה של בית החולים הראשון של אוניברסיטת ג'ג'יאנג (IIT20220330B).36 דגימות ספוגית אף נאספו, בהשתתפות 16 מבוגרים מתחת לגיל 30, 7 מבוגרים מעל גיל 40 ו-19 גברים, 17 נקבות.36 דגימות ספוגית אף נאספו, בהשתתפות 16 מבוגרים מתחת לגיל 30, 7 מבוגרים מעל גיל 40 ו-19 גברים, 17 נקבות.דגם 36 אובדן חדש, 16 ש"ח, 7 ש"ח, 9 ש"ח. и 17 женщин.שלושים ושש דגימות משטח האף נאספו מ-16 מבוגרים מתחת לגיל 30, 7 מבוגרים מעל גיל 40, 19 גברים ו-17 נשים.נתונים דמוגרפיים מוצגים בטבלה משלימה 3. הסכמה מדעת התקבלה מכל המשתתפים.כל המשתתפים נחשדו בשפעת ונבדקו מרצון ללא פיצוי.
הבסיס והמכסה FAST עשויים מחומצה פולילקטית (PLA) ומודפסים על ידי מדפסת Ender 3 Pro 3D (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).סרט דו צדדי נרכש מ-Adhesives Research, Inc. דגם 90880. סרט PET בעובי 100 מיקרומטר נרכש מ-McMaster-Carr.גם הדבק וגם סרט ה-PET נחתכו באמצעות חותך Silhouette Cameo 2 מבית Silhouette America, Inc. הסרט האלסטי עשוי מחומר PDMS על ידי הזרקה.ראשית, מסגרת PET בעובי 200 מיקרומטר נחתכה באמצעות מערכת לייזר והודבקה לגיליון PMMA בעובי 3 מ"מ באמצעות סרט דביק דו צדדי בקוטר 100 מיקרומטר.מבשר ה-PDMS (Sylgard 184; חלק א': חלק B = 10:1, Dow Corning) נשפך לאחר מכן לתוך התבנית ומוט זכוכית שימש להסרת עודפי PDMS.לאחר ריפוי ב-70 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות, ניתן היה לקלף את סרט ה-PDMS בעובי 300 מיקרון מהתבנית.
תמונות להפצה רב-תכליתית, פרסום לפי דרישה וביצועים אמינים צולמו עם מצלמה מהירה (Sony AX700 1000 fps).שייקר האורביטלי המשמש בבדיקת האמינות נרכש מ-SCILOGEX (SCI-O180).לחץ האוויר נוצר על ידי מדחס אוויר, ומספר ווסתי לחץ דיגיטליים משמשים להתאמת ערך הלחץ.תהליך בדיקת התנהגות הזרימה הוא כדלקמן.כמות קבועה מראש של נוזל הוזרקה למכשיר הבדיקה ומצלמה במהירות גבוהה שימשה כדי לתעד את התנהגות הזרימה.לאחר מכן נלקחו תמונות סטילס מסרטונים של התנהגות הזרימה בזמנים קבועים, והשטח הנותר חושב באמצעות תוכנת Image-Pro Plus, שהוכפלה לאחר מכן בעומק המצלמה כדי לחשב את הנפח.ניתן למצוא פרטים על מערכת בדיקת התנהגות הזרימה באיור משלים S4.
הזרקו 50 μl של מיקרו-חרוזים ו-100 μl של מים מופחתים לתוך מכשיר ערבוב הבקבוקון.צילומי ביצועים מעורבים צולמו עם מצלמה במהירות גבוהה כל 0.1 שניות בלחצים של 0.1 בר, 0.15 בר ו-0.2 בר.מידע על פיקסלים במהלך תהליך המיזוג ניתן לקבל מתמונות אלו באמצעות תוכנת עיבוד תמונות (Photoshop CS6).ויעילות הערבוב יכולה להיות מושגת עם משוואה 53 הבאה.
כאשר M הוא יעילות הערבוב, N הוא המספר הכולל של פיקסלים לדוגמה, ו-ci ו-\(\bar{c}\) הם הריכוזים המנורמלים והצפויים.יעילות הערבוב נעה בין 0 (0%, לא מעורבב) ל-1 (100%, מעורבב מלא).התוצאות מוצגות באיור משלים S6.
ערכת RT-PCR בזמן אמת עבור IAV ו-IBV, כולל דגימות RNA IAV ו-IBV (מספר קטגוריה RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, סין), חיץ Tris-EDTA (מאגר TE מס' B541019 , Sangon Biotech, סין), ערכת טיהור RNA בקרה חיובית (חלק מס' Z-ME-0010, Liferiver, סין) ו- GAPDH Solution (חלק מס' M591101, Sangon Biotech, סין) זמינים מסחרית.ערכת טיהור ה-RNA כוללת חיץ מקשר, כביסה A, כביסה W, eluent, מיקרו-חרוזים מגנטיים ומנשא אקרילי.ערכות RT-PCR בזמן אמת של IAV ו-IBV כוללות תערובת זיהוי חומצת גרעין PCR IFVA ואנזים RT-PCR.הוסף 6 µl של AcrylCarrier ו-20 µl של חרוזים מגנטיים ל-500 µl של תמיסת חיץ מחייבת, נער היטב ולאחר מכן הכן את תמיסת החרוזים.הוסף 21 מ"ל אתנול לשטיפות A ו-W, נער היטב לקבלת פתרונות של שטיפות A ו-W, בהתאמה.לאחר מכן, 18 μl של תערובת PCR ניאון עם חומצת גרעין IFVA ו- 1 μl של אנזים RT-PCR נוספו ל-1 μl של תמיסת TE, נערה וצנטריפוגה למשך מספר שניות, תוך קבלת 20 μl של פריימרים IAV ו-IBV.
בצע את הליך טיהור ה-RNA הבא: (1) ספיחת RNA.מטפטפים 526 μl מתמיסת הכדורים לתוך שפופרת צנטריפוגה של 1.5 מ"ל ומוסיפים 150 μl של דגימה, ואז נער ידנית את הצינור למעלה ולמטה 10 פעמים.העבירו 676 μl מהתערובת לעמודת הזיקה וצנטריפוגה ב-1.88 x 104 גרם למשך 60 שניות.הניקוזים הבאים נזרקים.(2) השלב הראשון של הכביסה.הוסף 500 μl של תמיסת שטיפה A לעמודת הזיקה, צנטריפוגה ב-1.88 x 104 גרם למשך 40 שניות, והשליך את התמיסה המושקעת.תהליך הכביסה הזה חזר על עצמו פעמיים.(3) השלב השני של הכביסה.הוסף 500 μl של תמיסת שטיפה W לעמודת הזיקה, צנטריפוגה ב-1.88×104 גרם למשך 15 שניות והשליך את התמיסה המושקעת.תהליך הכביסה הזה חזר על עצמו פעמיים.(4) שחרור.הוסף 200 μl של eluate לעמודת הזיקה וצנטריפוגה ב-1.88 x 104 גרם למשך 2 דקות.(5) RT-PCR: ה-eluate הוזרק לתוך 20 μl של תמיסת ה-primer בצינור PCR, ואז הצינור הוכנס למכשיר בדיקת PCR בזמן אמת (SLAN-96P) כדי לבצע את תהליך RT-PCR.כל תהליך הגילוי אורך כ-140 דקות (20 דקות לטיהור RNA ו-120 דקות לזיהוי PCR).
526 μl של תמיסת חרוזים, 1000 μl של תמיסת כביסה A, 1000 μl של תמיסת כביסה W, 200 μl של eluate ו-20 μl של תמיסת פריימר נוספו מראש ואוחסנו בחדרי זיהוי M, W1, W2, E ו- PCR.הרכבת פלטפורמה.לאחר מכן, 150 μl מהדגימה הוכנסו לפיפטה לתא M ופלטפורמת FAST-POCT הוכנסה למכשיר הבדיקה המוצג באיור משלים S9.לאחר כ-82 דקות, תוצאות הבדיקה היו זמינות.
אלא אם צוין אחרת, כל תוצאות הבדיקה מוצגות כממוצע ± SD לאחר מינימום של שישה חזרות תוך שימוש רק בפלטפורמת FAST-POCT ודגימות בלתי תלויות ביולוגית.לא נכללו נתונים מהניתוח.הניסויים אינם אקראיים.החוקרים לא היו עיוורים למשימות קבוצתיות במהלך הניסוי.
למידע נוסף על עיצוב מחקר, עיין בתקציר דוח מחקר הטבע המקושר למאמר זה.
נתונים התומכים בתוצאות מחקר זה זמינים במידע משלים.מאמר זה מספק את הנתונים המקוריים.
Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19 מאיצים במדינות עשירות יעכבו חיסונים לכולם.Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19 מאיצים במדינות עשירות יעכבו חיסונים לכולם.Chagla, Z. and Madhukar, P. COVID-19 בוסטרים במדינות עשירות יעכבו חיסונים לכולם.Chagla, Z. and Madhukar, P. COVID-19 חיסון מחדש במדינות עשירות יעכב את החיסון לכולם.רפואה לאומית.27, 1659–1665 (2021).
פאוסט, ל' ועוד.בדיקות SARS-CoV-2 במדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית: זמינות ובמחיר סביר במגזר הבריאות הפרטי.זיהום מיקרוביאלי.22, 511–514 (2020).
ארגון הבריאות העולמי.שכיחות ושכיחות עולמית של זיהומים נבחרים הניתנים לריפוי מינית: סקירה והערכות.ז'נבה: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.רצועות בדיקה מרובות של זרימת צד יצוקה דו מימדית.יישום ASS.אלמה מאטר.אינטר מילאנו.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM et al.מכשיר ניתוח מבוסס נייר מיקרופלואידי סגור לחלוטין.פִּי הַטַבַּעַת.כִּימִי.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. et al.אימונוכרומטוגרפיה תחרותית מבוססת נייר בשילוב עם אלקטרודות שעברו שינוי אנזים מאפשר ניטור אלחוטי וקביעה אלקטרוכימית של קוטינין בשתן.חיישנים 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.כימות סמנים ביולוגיים של מחלות עם פלטפורמת נוזלים רוחבית רב-תכליתית המשולבת בננוזים באמצעות גלוקומטר.חיישן ביולוגי.ביו-אלקטרוניקה.126, 690–696 (2019).
Boo, S. et al.רצועת בדיקת הריון לאיתור חיידקים פתוגניים באמצעות concanavalin A-human chorionic gonadotropin-Cu3(PO4)2 ננופרחים היברידיים, הפרדה מגנטית וקריאת טלפון חכם.מיקרו מחשב.מגזין.185, 464 (2018).